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植物種質超低溫保存

作者:天馳液氮罐 來源:原創 日期:2016-04-22 8:17:12 人氣:10 加入收藏 標簽:低溫保存

  植物種質超低溫保存

  近幾十年中,離體培養技術得到了全面的發展,隨之超低溫保存技術也發展起來的。這種無菌保存形式不受空間、勞動力等條件的限制,具有取材方便、設備簡單、費用少等特點,可以克服活體保存時難以解決的困難。此外,該法可以避免種質保存過程中發生變異,從而保證種質的遺傳穩定性。

  1超低溫保存原理

  超低溫保存是指在液氮(-196℃)中保存植物種質資源(如細胞、組織、器官等離體材料)的一整套生物學技術。在液氮條件下,可以大幅減緩甚至終止材料的細胞分裂和生理代謝,減少遺傳變異的發生,使生物材料的穩定性得以保存,但不會改變形態發生的潛能。從理論上講,植物生長在液氮中處于完全停止狀態,植物材料保存期可以無限延長。與傳統保存方法相比,超低溫保存以其設備簡單、無需昂貴儀器、材料處理步驟方便等優點克服了傳統保存方法的不足,是目前植物種質資源唯一不需要繼代且能夠長期穩定保存的方式。

  Nag和Street于1973年用超低溫技術成功保存了胡蘿卜的懸浮細胞,拉開了植物種質超低溫保存的帷幕。隨著超低溫保存技術的不斷發展,國內外已對200多種材料進行了超低溫保存。常用的超低溫保存方法主要有慢凍法、快凍法、包埋/脫水法、玻璃化法、包埋/玻璃化法5種。慢凍法為最早的超低溫保存方法,步驟較為復雜,但對原生質體和懸浮細胞的保存效果比較好;快凍法隨著技術的改進于20世紀90年代發展為玻璃化法。目前,包埋/脫水法、玻璃化法和包埋/玻璃化法為植物種質資源常用的超低溫保存方法。

  2超低溫保存方法

  2.1包埋/脫水法指將材料用藻酸鹽包埋,置于高濃度蔗糖的培養基中預培養,然后在通風櫥或硅膠中干燥脫水處理一段時間后投入液氮進行超低溫保存。其優點在于操作易掌握,簡化和緩和脫水程序,可避免一些冰凍保護劑對細胞產生毒性,并且一次能處理較多的材料。但與玻璃化法相比,脫水所需時間長,組織恢復生長較慢,再生率低。

  2.2玻璃化法材料經過高濃度冰凍保護劑處理一段時間,然后快速投入液氮中,此時保護劑和細胞內的水分子來不及或難以形成冰晶,就會同時進入完全玻璃化狀態,在這種狀態下,水分子不會發生重組,結構和體積也不會產生變化,從而保證了細胞再生的活力,有利于材料后期的恢復。玻璃化超低溫保存時,固化形成玻璃態即冷凍材料進入液氮的瞬間和化凍時沒有再結晶這一過程至關重要,它決定著超低溫保存后材料的存活率。1989年Uragami和Langis等首次成功的應用玻璃化法保存植物種質資源。

  小滴玻璃化法是在玻璃化法的基礎上,將包含有材料的玻璃化溶液滴在鋁箔上,然后再放入液氮。此法保存材料時降溫比較均勻,可以提高材料的再生成活率。小滴玻璃化法已被成功應用到大蒜、蘆筍等多種植物莖尖的超低溫保存中。玻璃化法超低溫保存以其技術設備簡單、無需昂貴儀器、材料處理步驟方便、效果和重演性好等優點使其在植物的超低溫保存中得到廣泛的應用。但該法保護劑中的DMSO對植物有毒害作用,并且在同一時間內較難處理大量的材料。

  2.3包埋/玻璃化法該法是結合包埋/脫水法和玻璃化法兩者的優點而建立的一種超低溫保存方法。其與包埋脫水法不同之處在于用玻璃化溶液處理代替干燥過程,進行脫水處理后,包埋珠與玻璃化液一同進入玻璃化狀態。它具有能同時處理大量材料,降低脫水率,降低細胞內外滲透壓,材料處理后再生率高等優點。1991年Tannoury首次用該法對康乃馨莖尖分生組織進行超低溫保存,并獲得了成功。隨后,在馬鈴薯、鐵皮石斛等20余種植物的超低溫保存中都得到應用,由此可見,其在保存植物種質資源上具有巨大的應用潛力,如鳳梨用幾種不同超低溫方法保存,結果表明包埋玻璃化法較其他保存方法可獲得更高的成活率。


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