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胚胎腦組織液氮保存與移植的實驗研究

作者:天馳液氮罐 來源:原創 日期:2015-01-27 8:39:23 人氣:15 加入收藏 標簽:液氮 液氮保存

  本實驗觀察了大鼠胎腦組織在液氮中保存的細胞存活率,并用保存的組織和新鮮組織做同種異體移植實驗。

  一、實驗方法
  正常妊娠15~21天的SD大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后,在無菌條件下剖腹取胎,切取所需胎腦組織,制成1mm大小的組織塊。用吸管將其移入含10%二甲基亞砜(DMSO)的無血清DMEM培養液中,裝進凍存管,于4℃平衡1小時后置入-30℃冰箱。約1小時后標本溫度降至-30℃(降溫速率為0.5℃~1.0℃/分),然后放入液氮中保存。需要時,取出凍存管于37℃水浴中復溫,冰塊熔化后再用Hank液以1∶1比例對凍存液反復稀釋4次,每次3分鐘。此時即可用于檢測和移植。細胞存活率檢測先采用胰酶消化制成細胞懸液,用0.4%臺盼藍染色1分鐘,再按血球計數方法對死活細胞分別計數,求出細胞存活率。腦內組織移植分A、B兩組進行,每組12只,分別進行新鮮組織移植和保存組織移植。兩種組織均取自胎鼠頂葉,前者離開母體時間不超過20分鐘,后者在液氮中保存30天。采用左頂葉皮層切開移植,每次植入3~5塊組織。飼養6~8周后處殺,取腦,連續石蠟切片,進行HE、Nissl和嗜銀染色。

  二、結果
  細胞存活率觀察:不同部位組織在液氮中保存10天和30天,細胞存活率(%)大腦組織為67.78±4.46和65.14±4.55,小腦組織為68.93±5.67,腦干組織為71.07±7.43和69.63±1.99。經方差分析,三種組織之間細胞存活率差別不顯著(P>0.05),不同保存時間之間細胞存活率差別也不顯著(P>0.05)。
  腦內移植組織學觀察:A組移植物成活例數7/12,移植物位于皮層下或伸入側腦室,體積較大,周邊有薄層膠質細胞反應帶。移植物內是均勻分布的大型神經元和少量散在的膠質細胞。神經元核大,染色淡,核仁清楚,并可見到雙核仁細胞,胞漿中尼氏小體豐富。移植物內有新生血管結構及比較致密的神經纖維網,在交界面上也有少量神經纖維。B組移植物成活例數2/10(2例感染不計),移植物位于皮層下,體積小,呈散在的細胞團樣,神經元核大淡染,胞漿不豐富。移植物內也可見到血管內皮細胞,嗜銀染色見移植物中神經纖維稀少。

  三、討論
  本實驗考察了兩步法梯度降溫液氮保存胎腦組織的可能性。此法保存大鼠胎腦組織10天和30天平均細胞存活率在60%~70%。將新鮮的和保存30天的組織植入同種大鼠腦內,組織學檢查發現兩組都有移植物成活,但是與新鮮組織移植相比,保存的組織移植后移植物體積小,神經元數量少,胞漿不豐富,移植物內神經纖維少見,表明神經元分化較差。結果提示,用兩步法梯度降溫液氮保存胎腦組織可取得較高的細胞存活率,移植后也有一定的成活率,但是移植物成活質量明顯不如新鮮組織移植。所以,這種保存方法能否實際應用還值得討論和進一步研究。

本文網址:http://www.thomastrials.com/shiyan/1086.html
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