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不同復溫方法對液氮保存人同種瓣活性影響的實驗研究

作者:天馳液氮罐 來源:原創 日期:2015-01-29 8:32:56 人氣:37 加入收藏 標簽:液氮 液氮保存

目的:尋找一種能最大程度保持液氮貯存人同種主動脈瓣活性的復溫方法。
方法:同種主動脈瓣(n=36)隨機分為6組,Ⅰ組為新鮮同種主動脈瓣,Ⅱ~Ⅵ組經液氮保存3月后,分別采用①42℃水浴復溫(Ⅱ組),②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組),③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組),④(10.0±2.0)℃/min(Ⅴ組);⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)。將同種主動脈瓣復溫至4℃,對所有同種主動脈瓣進行臺盼藍染色活細胞計數、24小時葡萄糖代謝率測定,氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入、瓣膜組織培養。
結果:上述指標Ⅰ組顯著優于其余各組(P<0.05),Ⅳ組優于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P<0.05)。組織培養Ⅰ組細胞生長優于其余各組,且早于各組3~4天。
結論:不同復溫方法對同種主動脈瓣活性影響不同,以4℃/min勻速復溫法對同種主動脈瓣活性影響最輕。

關鍵詞:同種 主動脈瓣 活性

  我們通過本研究觀察不同復溫方法對同種瓣活性的影響,旨在尋找一種能較好保持同種瓣活性的復溫方法,為臨床合理應用同種瓣提供依據,現報道如下。

材料與方法
  1.取材分組 于1995年10月~1996年5月選擇46例健康成人腦死亡者,于死亡30分鐘內,在無菌條件下取出心臟,隨機抽取36例(年齡20歲~32歲,平均26歲)分為6組(n=36)。4℃生理鹽水
沖洗、修剪,保留主動脈瓣,插入銅-康銅熱電偶測量電極,將同種瓣置入含萬古霉素(50mg/L)、二性霉素(25mg/L)的RPMI1640液,經4℃過渡2小時后移入液氮氣相中放置2小時,然后置入液氮中,保存3月后取出,分別以①42℃水浴復溫(Ⅱ組);②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組);③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組);④(10.0±2.0)/min(Ⅴ組);⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)的速率將同種瓣復溫至4℃,新鮮未冷凍同種瓣對照(Ⅰ組)。
  2.溫度測量控制裝置與方法 根據升降式降溫儀原理,自制復溫裝置,如圖1所示。


圖1 升降式溫度測量控制裝置
1 液氮容器 2 銅-康銅熱電偶
3 同種瓣保存袋 4 液氮 5 旋轉升降器 6 冰瓶
7 植物油 8 標準探極 9 冰水 10 數字式萬用電表

  3.測量探極置于同種瓣葉內,標準探極插入冰水瓶,測量兩探極之間電勢差,依公式與攝氏溫度換算。根據復溫速度要求,將含有同種瓣材料的托盤,通過細繩由旋轉升降器牽引上升,利用萬用電表顯示電勢差,控制升降速率。換算公式:U=0.0385t+0.00004t2-5.4295×10-8t3,其中U為電勢差值(單位:mV),t為攝氏溫度值(單位:℃)。
  4.實驗方法?、倥_盼藍染色法:0.25%胰酶消化剪碎的主動脈瓣葉,270目纖維濾膜過濾,濾液1200轉/分離心15分鐘,棄上清液,按1∶1將5%臺盼藍加入細胞懸液,光學顯微鏡計數。②葡萄糖代謝率測定:每10mg瓣膜組織中加入RPMI1640液1ml,在37℃、5%CO2孵箱中孵育24小時后用自動生化分析儀作葡萄糖定量測定。代謝率[mmol/(mg.24h)]其中RPMI1640液原液同條件下葡萄糖定量為11.3mmol/L。③氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入量:瓣葉組織在孵育中加入3H-TdR 2μci,24小時后取出瓣葉,經漂洗后加入2mol/L NaOH,加熱將其溶解,加入閃爍液10ml,用自動液閃計數儀計數(CPM)。3H-TdR參入量[CMP/(mg.24h)]=,其中RPMI1640原液本底為27CPM。④組織培養:以組織塊貼壁方法在37℃、5%CO2孵箱中RPMI1640培養液培養,每周換液2次,每次半量,待組織塊周邊有細胞長出后,拍照。
  5.統計學方法 臺盼藍染色活細胞百分率行組間χ2檢驗,葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量以Image12.gif (851 bytes)±s表示,行組間t檢驗,P<0.05差異有顯著意義。

結 果
  臺盼藍拒染細胞百分率、葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量結果見表1。表1顯示:Ⅱ~Ⅵ組活細胞百分率(主要為內皮細胞)顯著低于Ⅰ組(P<0.05);而Ⅳ組又顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P<0.05);Ⅰ組葡萄糖代謝率、3H-TdR參入量顯著高于其它各組(P<0.05),Ⅳ組又顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P<0.05)。組織培養Ⅰ組細胞生長優于其余各組,且早3~4天。Ⅱ~Ⅵ組培養,Ⅳ組細胞生長優于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組。


討 論
  同種瓣形態結構的完整決定著其耐久性。瓣膜冷凍保存不同于單細胞,由于細胞成分多樣,細胞間質存在,在復溫過程中,使熱量交換不均勻,外周組織內冰晶融化可從內部吸收熱量,使內部組織再結晶加重,可造成細胞嚴重的機械性損傷。另外,低溫蛋白質的變性,脂質的丟失,細胞膜通透性的改變以及細胞膜上小孔的形成,使水分子易通過細胞膜,引起細胞內水負荷加重,超過一定時間或程度時,細胞便會破裂。本研究結果發現,不同復溫速率對液氮保存的同種瓣均有損害。臨床上常用的42℃水浴復溫法,其復溫速率不均勻,細胞損害重,活性低,可能與細胞再結晶重,高水負荷狀態持續時間長有關。30℃/min和10℃/min復溫,溫差大,細胞內再結晶重。1℃/min復溫,雖然再結晶輕,但細胞內高水負荷持續時間長,細胞損害亦重。4℃/min復溫方法較好地保持了細胞活性,可能與熱交換時間充裕,再結晶輕,細胞內高水負荷狀態未超臨界值有關。

本文網址:http://www.thomastrials.com/shiyan/1090.html
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