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用液氮冷凍真空保存犢牛睪丸原質細胞

作者:天馳液氮罐 來源:原創 日期:2015-12-11 8:22:56 人氣:23 加入收藏 標簽:液氮冷凍

  犢牛睪丸細胞作為多種病毒增殖的基質,已經應用在疫苗生產中,并有廣泛的開發前景,但是由于產犢季節的不均衡,給生產帶來了困難,為了使生產不受季節影響,同時為了避免由保存原代細胞量大、細胞復活率低的問題,做了用液氮冷凍保存犢牛睪丸原質細胞的試驗。

  1 材料與方法

  1.1犢牛睪丸 出生三天內的,未食初乳的本地黑白花公奶牛。

  1.2細胞冷凍液的配制

  冷凍液Ⅰ號:按本實驗室設計的方法配制,配方略。

  冷凍液Ⅱ號:按常規方法配制,即含20%特牛血清,含5%~10%二甲基亞礬的營養液。

  1.3待凍存細胞的制備

  1.3.1原質細胞的制備:將犢牛睪丸細胞經一定方法處理后,即在原質細胞自己接加入細胞凍存液中待凍,一般一對牛犢睪丸制備的原質細胞可分裝于3~5個安瓶中。

  1.3.2原代細胞的制備:按常規方法消化犢牛睪丸,制得細胞懸液,放置37℃溫室培養,3~4天形成致密單層后,按常規法消化、洗滌、離心,收集細胞泥,分別加入適量的細胞冷凍液,待凍。

  1.3.3次代細胞的制備:將原代細胞按常規方法消化、培養,得次代細胞單層,再按上述方法收集細胞泥,加入適量細胞冷凍液,待凍。

  2 細胞的冷凍

  將上述加入細胞冷凍液Ⅰ號或Ⅱ號液的原質細胞、原代細胞、次原代細胞的細胞瓶,放置4℃、30分鐘,再移到-50℃~-70℃冰箱中預冷2小時,然后迅速移到液氮罐中。

  3 細胞復蘇

  將安瓶自液氮罐中取出,立即放入38-40℃溫水中,使細胞在1分鐘內融化,無菌吸出細胞懸液,加入新的生長液,將細胞稀釋成50萬個細胞/ml,37℃培養4小時,細胞貼壁后換液一次,繼續增減形成單層細胞。

  4 結果與討論

  實驗結果如下:

  備注:

  1 每批凍存細胞凍前都有正常細胞培養對照,以確定細胞消化成功與否。

  2 凍存細胞復活率是指復蘇后細胞數/凍前活細胞數比值。

  3 細胞生長情況批復蘇后37℃培養4天時細胞生長的致密情況。

  4 復蘇后的細胞接毒培養后,均能有效帶毒,同正常培養細胞無差別。

  從上表可以看出:

  1 用凍存方法保存牛睪丸原質細胞,方法是可行的,這給應用牛睪丸細胞增值病毒的生產和試驗帶來了極大的方便,有利于適當安排生產,同時給器官細胞的保存提供了可靠的依據。

  2 從上表可見應用本實驗室配制的細胞凍存液凍存的細胞,復蘇后的存活率要比正常的細胞凍存液要高。

  3 從上表可以看出,原代、次代細胞經凍存后,復蘇的存活率為零,具體原因有待于今后進一步探討。

本文網址:http://www.thomastrials.com/shiyan/1384.html
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