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探索超低溫冷凍對綿羊卵母細胞四跨膜蛋白CD9的影響

作者:天馳液氮罐 來源:原創 日期:2016-10-26 8:12:45 人氣:81 加入收藏 標簽:超低溫冷凍 冷凍保存

1.卵母細胞的采集和體外成熟培養(IVM

從屠宰場收集的新鮮綿羊卵巢太子彩票网址,放在滅菌過并預熱的37℃、0.9%生理鹽水保溫杯中,送到實驗室。再用同樣生理鹽水清洗卵巢2~3遍太子彩票网址,直至干凈。使用抽吸法吸取卵泡液,顯微鏡下篩取顆粒細胞緊密的卵丘卵母細胞復合體(COCs)太子彩票网址,放入預先加熱的采卵液和成熟液各洗3次,放入成熟微滴中,CO2培養箱中培養2324h太子彩票网址。培養時間結束后使用透明質酸酶去顆粒細胞進行10~15min的消化。在顯微鏡下挑選形態完整、胞質均勻并排出第一極體的卵母細胞太子彩票网址。

2.卵母細胞的冷凍保存

BS、VS、ES預先在室溫下平衡20min左右,再把處理好的細胞放入BS中稍微洗滌后就移入ES中停留5~10min,經過皺縮又復張到原先大小的80%為止,再移入VS后一并吸入冷凍管中,投入液氮罐中進行冷凍保存。

3.解凍

1.0mol/L蔗糖溶液37℃預熱20min太子彩票网址,再將1.0、0.5太子彩票网址、0.25mol/L蔗糖溶液和BS分別放入預熱的4孔皿中,室溫下平衡20min。將冷凍細胞分別在上述梯度蔗糖溶液中分別放置3min太子彩票网址,最后轉入BS中,緩慢升溫5min,即可進行下一步試驗。

4.免疫組化

用預熱的生理鹽水清洗卵巢后放入4%多聚甲醛中太子彩票网址,4℃固定24h,然后移入30%蔗糖溶液中脫水,脫水至卵巢在自然狀態下下沉至底部即可。將處理好的卵巢放入冷凍切片機里冷凍30min,用O.C.T.包埋。切片厚度為10μM的卵巢放在防脫載玻片上放進PBS溶液中4℃過夜。用0.1%TritonX-100里通透30min,用PBS在脫色搖床上搖洗3次,每次10min。然后放入CD9一抗Anti-CD9Antibody1:100)(陰性對照加PBS代替一抗)中4℃過夜。經一抗孵育的切片用PBS搖洗3次,每次10min后室溫搖床孵育二抗GoAtAnti-rAbbitI9GH&L1:200)孵育1~2h太子彩票网址,再用PBS搖洗3次,每次10min。DAPI室溫孵育5min,PBS搖洗3次,最后滴加抗熒光淬滅劑,即可熒光顯微鏡觀察。

5.實時熒光定量PCR

1)綿羊卵母細胞總RNA的提取 RNA提取依據微量樣品總RNA提取試劑盒說明書進行。卵母細胞的收集同1.2.1、1.2.21.2.3步驟,各收集300個新鮮GV期太子彩票网址、MⅡ期卵母細胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細胞,離心去上清加入350μL終濃度1%裂解液,再加5μL的4ng/μLCArrierNA工作液,勻漿太子彩票网址,加入1倍體積70%乙醇,再將所有液體移入吸附柱crⅠ上放進離心管里,12000r/min離心1min,棄廢液。加350μL去蛋白液,12000r/min離心1min,棄廢液。管中加80μL配制好得dnAsEⅠ工作液太子彩票网址,室溫放置15min加350μL去蛋白液,12000r/min離心1min太子彩票网址,棄廢液。再加500μL漂洗液太子彩票网址,室溫放置2min,12000r/min離心1min,棄廢液。12000r/min離心2min,棄廢液,置于室溫數分鐘以徹底曬干殘余漂洗液。將吸附柱crⅠ放入新的離心管中太子彩票网址,加入14μLrNAse-freeddh20,室溫放置2min,13000r/min離心2min,所得溶液為RNA溶液。用酶標儀測定RNA的D260nm/D280nm值。

2)RNA反轉錄合成cDNA 按照Pri-mESCriptTMrTMAsterMix(PerfectreAl-time)試劑盒說明書,PCR反應總體系為20μL:5×Prime-ScriptTMrTMAsterMi4μL,rNA5.5μL太子彩票网址,rNAse-freeddh2O10.5μL。輕輕混勻太子彩票网址,37℃15min太子彩票网址,85℃5s,溫度降到4℃終止反應,-80℃保存。

3)實時熒光定量PCR 利用SYBr PreMiETAqTMⅡ檢測綿羊卵母細胞CD9基因的相對表達量。引物序列見表1

PCR擴增體系20μL:SYBR(PreMixExTAqTMⅡ(2×)10μL太子彩票网址,ROXReferenceDye(50×)0.4μL太子彩票网址,上、下游引物(10μMoL/L)各0.5μL,RNAse-free ddH2O7.6μL,cdnA1μL。每個樣品做3個技術重復和3個平行試驗。PCR反應程序:95℃30s;95℃30s,61℃30s,72℃20s太子彩票网址;95℃1Min,55℃30s;95℃30s。反應結束后根據所得ct值計算CD9mRNA的相對表達量太子彩票网址,采用sAs軟件中GLM進行方差分析,并使用鄧肯氏多重比較,P<0.05為差異顯著。

6.Western blotting分析 卵母細胞的蛋白提取采用了細胞總蛋白提取的方法。同1、2和3步驟收集新鮮GV期、MⅡ期卵母細胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細胞各500個,10000R/Min離心2Min,棄上清液。震蕩至細胞沉淀完全擴散。加28μLRiPA裂解液太子彩票网址,用超聲波破碎儀破碎數秒后再加2μLPMSF蛋白酶抑制劑和2μLβ-巰基乙醇太子彩票网址,整個過程均在冰上進行,最后加8μLSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)充分混合后,95℃變性5Min。配制5%濃縮膠和12%分離膠,進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在20MA電流、20MV恒壓的條件下進行轉膜,取出PVdF膜后放入封閉液中,室溫搖床1~2h太子彩票网址,以便去掉膜上的非特異性蛋白,提高目的蛋白與抗體的特異性結合。分別放入Anti-CD9Antibody(1:1000)和MsMAbtobEtAActin(1:2000)中,4℃過夜。取出與一抗孵育的膜太子彩票网址,用洗膜液搖洗3次太子彩票网址,每次10Min。再分別與CD9二抗donKEyAnti-RAbbitiGGh&L(hRP)(1:2000)和β-Actin二抗GoAtAnti-MousEiGG(h&L)hRPconJuGAtEd(1:2000)在室溫搖床孵育1~2h,洗滌3次,每次10Min,dAb染色太子彩票网址,觀察結果太子彩票网址。

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