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液氮凍存降低成骨細胞免疫原性的實驗研究之材料與方法

作者:天馳液氮罐 來源:轉載 日期:2014-07-05 9:09:32 人氣:9 加入收藏 標簽:液氮 液氮凍存

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器

胰蛋白酶、膠原酶、二甲基亞砜(DMSO)、絲裂霉素C(Sigma,USA)胎牛血清太子彩票网址太子彩票网址、淋巴細胞分離液。培養液(Gibco太子彩票网址,USA)太子彩票网址。倒置相差顯微鏡(Olympus,japan)。液體閃爍儀(Beckman,USA)太子彩票网址。新西蘭大白兔(山東省農科院)。3H-TDR(山東大學核醫學研究所)。一抗:MOUSE ANTI RABBIT MHG CLASS I (Serotic 公司,UK)。IGg1-FITC(PHARMINGEN公司太子彩票网址,USA)。流式細胞儀(BECTON-DICKINSON,USA)

1.2POBs的培養 鑒定

無菌切取新西蘭大白兔脛骨骨膜太子彩票网址,切至1mm*1mm*1mm大小。0.25%胰蛋白酶消化20~30min,0.1% I型膠原酶消化2h,至組織塊成粘糊狀,大部分有核細胞已游出。加入DMEM培養液洗滌,再按105個/ml接種到培養瓶太子彩票网址,置于含5%CO2飽和濕度培養箱中培養,每2~3d換液一次,當細胞融合接近單層時傳代培養太子彩票网址。用堿性磷酸酶及茜素紅S染鈣法染色鑒定。

1.3 POBS凍存及復蘇

細胞凍存:取生長狀態較好的4~8代細胞,吹打至單細胞懸液,加入凍存液10%二甲基亞砜(DMSO)太子彩票网址,401%胎牛血清(FBS),50%細胞培養液(DMEM),放置于凍存管太子彩票网址,4度冰箱預冷20~30min,-20度冰箱30min,-80度冰箱過夜,后置于液氮罐中。

細胞復蘇:POBs凍存3月后,自液氮罐中取出凍存管 迅速放入37度水浴中,反復搖動,使其迅速融化。DMEM培養液沖洗,800r/min離心5min太子彩票网址太子彩票网址,用含10%FBS的DMEM重新懸浮細胞。做臺盼藍染色實驗太子彩票网址,計算細胞存活率。按4*105~6*105個/ml濃度接種于培養瓶太子彩票网址,置入37度、5%CO2飽和濕度培養箱中傳代培養。

對照組細胞:用酶消化法原代培養,獲取新鮮的成骨細胞,傳至4-8代,作為未凍存組的細胞。

1.4 成骨細胞MHC-I抗原測定

成骨細胞的收集:將新鮮培養的成骨細胞及凍存復蘇后的成骨細胞,加入0.25%胰蛋白酶數毫升消化并反復吹打成單細胞懸液,并使每管細胞數﹥106個。

漂洗:將離心后的細胞棄去上清液太子彩票网址,加入無Ca2+太子彩票网址、Mg2+的PBS 8~10ml,用吸管吹打成細胞懸液,離心;如此漂洗3次太子彩票网址,徹底洗凈培養液。

末次保留0.5ml上清液,用振蕩器使細胞分散太子彩票网址。

用細滴管或注射器,將細胞懸液滴入4℃冷乙醇溶液(濃度70%)中,邊滴加邊震蕩。

用400目尼龍網過濾一次后,調整細胞濃度為106個/ml。

抗體標記:加一抗(MOUSE ANTI RABBIT MHC CLASS)10ul,4攝氏度閉光放置30min太子彩票网址。用無Ca2+、Mg2+的PBS洗滌2次太子彩票网址,加二抗(GOAT ANTI MOUSE IGg:FITC)50ul,充公振蕩,4℃閉光放置30min。陰性對照組加入IGg1-FITC。

洗滌固定:加PBS 2ml洗滌2次,1000r/min、離心5min太子彩票网址太子彩票网址。加0.5ml1%多聚甲醛懸浮細胞。用流式細胞儀測定太子彩票网址。

1.5 成骨細胞 淋巴細胞混合培養體系的建立

1.5.1 淋巴細胞的分離

抽取兔靜脈血3~4ml,放入抗凝管,Hanks液稀釋 1~2倍。取聚蔗糖-泛影葡胺分層液3~4ml,放入離心管中,用毛細管吸取稀釋血液,加入分層液上,水平離心機以2000r/min離心30min太子彩票网址,吸取單個核細胞層,洗滌。

1.5.2 POBs的滅活

將新鮮培養的成骨細胞和凍存復蘇后的成骨細胞吹打至單個細胞懸液,分別加入絲裂霉素C(50ug/ml),作用30~40min,消除其分裂增殖能力。

1.5.3 混合培養

將滅活成骨細胞及淋巴細胞各1*105個,接種于96孔板中(分2組太子彩票网址,未凍存組及凍存組各16孔),置于37攝氏度、5%CO2飽和濕度培養箱中培養56h,加入3H-TdR 1.0uCi/bnn(1uCi=37kBq),培養16h。

1.5.4 β液閃記數儀測定

測每分鐘閃爍數(cpm值),以自體淋巴細胞和成骨細胞混合培養組作為陰性對照組,計算刺激指數(stimulaton index,SI)。SI=(實驗組cpm值-機器本底cpm值)/(陰性對照組cpm值-機器本底cpm值)。

1.6 數據處理

SPSS10.0 統計軟件進行數據處理,采用配對樣本t檢驗太子彩票网址,并進行正態分布檢驗,方差齊性檢驗。


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