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超低溫冰箱轉液氮階梯降溫法與傳統程序降溫法保存造血干細胞的比較

作者:天馳液氮罐 來源:原創 日期:2014-08-12 17:25:12 人氣:182 加入收藏 標簽:液氮 液氮階梯降溫

摘 要:
背景:在造血干細胞整個冷凍保存過程中,受到降溫速率、儲存溫度深淺、冷凍保護劑組合等因素影響,各國學者在提倡選擇何種保存方法上面存在不同的主張。
目的:比較-80℃低溫冰箱轉液氮階梯降溫法與傳統程序降溫法保存外周造血干細胞的效果。
方法:將采集的造血干細胞分兩組,第一組細胞濃度為1×1011L-1,加入10%二甲基亞砜,放入程序冷凍儀內程序設置為室溫至-4℃按1℃/min的速率降溫,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷凍管置-196℃液氮罐內。第二組細胞濃度為1×1011L-1,加入5%二甲基亞砜、3%羥乙基淀粉、4%人血白蛋白,將冷凍管置-80℃冰箱過夜后取出,置-196℃液氮罐內的氣相,再過夜后置液氮罐液相內。
結果與結論:兩組冷凍方法保存細胞的錐蟲藍拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差異無顯著性意義(P〉0.05)。結果顯示用5%二甲基亞砜、4%白蛋白、3%羥乙基淀粉組成的冷凍保護劑,通過-80℃低溫冰箱轉液氮階梯降溫法冷凍保存造血干細胞與傳統10%二甲基亞砜作為冷凍保護劑用程序降溫的方法取得一樣效果,操作簡便易于臨床應用。

0 引言

低溫冷凍技術一直都是造血干細胞移植中至關重要的技術之一。目前,造血干細胞的低溫冷凍保存采用兩大方法:程序降溫-196℃液氮保存和非程序降溫-80℃低溫冰箱保存,兩種方法各有優缺點,程序降溫法保存期長,但程序降溫法實驗過程費時,需要購買設備多,非程序降溫-80℃低溫冰箱保存法操作簡便,但保存期短,且受停電及冰箱工作狀態等影響。

實驗探尋一種能二者兼顧而又不降低細胞存活率的凍保存方法。

1 材料和方法

設計:低溫保存方法優化革新后的效果比較。

時間及地點:實驗于2009-01/2010-04在云南省第一人民醫院血液科實驗室及檢驗科流式細胞室完成。

材料:

標本來源:行自體外周血造血干細胞移植患者,采用大劑量阿糖胞苷、大劑量環磷酰胺或足葉乙甙,阿糖胞苷方案化療聯合粒細胞集落刺激因子進行動員,在第4或第5天用Cobe Spectra血細胞分離機采集外周血造血干細胞。

方法:

細胞分組及凍存方法:將采集的造血干細胞分兩組,第1組加入DMSO使其終濃度為10%,細胞濃度為1*1011L-1,分裝到2mL的冷凍管內共4只。第2組加入DMSO,羥乙基淀粉,人血白蛋白,終濃度分別為5%,3%,4%,細胞濃度為1*1011L-1,分裝到2mL的冷凍管內共4只,第1組放入程序冷凍儀內程序設置為室溫至-4℃摟1℃/min的速率降溫,按35℃/min快速降至-45℃,再發15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min,降至-90℃出冷凍管置-196℃液氮罐內。第2組將冷凍管置-80℃冰箱過夜后取出,置-196℃液氮罐內的氣相,再過夜后置液氮罐液相內。

復溫:從液氮罐內取出第1組、第2組冷凍管投入40℃恒溫水浴箱內,待融化后取出混勻。

主要觀察指標:取復溫后的細胞20UL加入含360UL PBS稀釋液和20UL錐蟲藍染液的EP管內混勻,然后從中取20UL充入細胞計數池,計數100個細胞,被染藍色者為死細胞,透亮者為活比較低,3min內計數完畢。AnnexinV-F,PI,Caspase-3表達檢測參照試劑盒說明書操作處理細胞,結束后上流式細胞儀分析10000只細胞,記錄陽性表達細胞比例。

統計學分析:所有資料經質控后采用SPSS13.0軟件進行統計分析,各組數據經方差齊性檢驗,方差齊,采用T檢驗。

2 結果

2.1 程序降溫組和-80℃冰箱組流式細胞儀檢測結果
兩組細胞AnnexinV-F,PI,Caspase-3表達進行統計分析,差異均無顯著性意義(P>0.05)。見表1。

2.2 程序
降溫組和-80℃冰箱組錐蟲藍拒染率和回收率
兩組細胞錐蟲藍拒染率和回收率結果進行統計分析,兩組比較差異均無顯著性意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

程序降溫-196℃液氮保存和非程序降濁-80℃低溫保存這兩種方法,目前在臨床均得到廣泛應用。程序降溫深低溫液氮冷凍保存可提前設定降溫速率,使降溫過程標準化,最大程度地減少降溫對造血干細胞的損傷。最后置于液氮中儲存,保存的長期性和安全性均可得到保障。但程序降溫過程耗時較長,同時需要購置昂貴的程序冷凍儀。

因此,程序降溫冷凍保存難以在多數醫院得到推廣。非程序降溫的-80℃低溫冰箱保存操作簡便,但不能達到足夠長的保存期,且受停電等影響,冰箱工作狀態難以保證。在造血干細胞整個冷凍保存過程中,受到降溫速率,儲存溫度深淺,冷凍保護劑組合等諸多因素的影響,因此不一致的研究結果導致了在提倡選擇何種保存方法上面存在不同的主張。

非穿透性保護劑可作用于細胞膜的外面,影響滲透壓和梯度,阻礙細胞內水外流,也可提高細胞外液黏滯度和降低細胞外液電解質的濃度而發揮保護作用,但單一使用低溫保護效果差。穿透性保護劑相對他子質量小,滲透性強,易于穿透細胞膜而減少細胞內冰晶形成,它對細胞的保護效果有計量-效應關系,一般需要較高的濃度,高濃度同時增加了毒性。課題組將穿透性保護劑二甲基亞砜降低濃度后非穿透性保護劑羥乙基淀粉混合使用于-80℃超低溫冰箱保存造血干細胞后,再由冰箱轉入液氮罐內保存即可解決超低溫冰箱保存期短,受停電及冰箱上工作狀態影響等問題,而操作較程序降溫法簡便,設備資金投入低,同時降低了二甲基亞砜的使用濃度減少毒副作用,各期凋亡,死亡和拒染率與程序降溫法結果相近,而臨床研究中該方法保存的細胞用于移植患者后與10%二甲基亞砜冷凍保護劑程序降溫法保存的細胞用于移植患者后臨床移植效果一樣,這樣的結果與國外同行研究的結果相近,因此用-80℃超低溫冰箱保存造血干細胞后,再由冰箱轉入液氮罐內保存,該方法資金投入低,操作簡便易于臨床使用,可以進一步擴大臨床研究病例以得到更客觀的數據。

本文網址:http://www.thomastrials.com/shiyan/832.html
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