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-80℃冰箱降溫—液氮凍存臍血造血干細胞

作者:天馳液氮罐 來源:轉載 日期:2014-09-05 9:12:52 人氣:142 加入收藏 標簽:液氮 液氮凍存

摘 要:為臍血造血干細胞(CBHSC)的凍存建立簡便有效的方法,采用5%二甲基亞砜(DMSO)加6%羥乙基淀粉(HES)為冷凍保護劑,不用程控降溫裝置,直接置CBHSC于-80℃冰箱中降溫,次日移至液氮液中保存1周、1個月、3個月、6個月.結果凍存6個月后,單個核細胞(MNC)、粒-單系造血祖細胞(CFU-GM)和CD+34細胞的回收率及MNC的臺盼藍拒染率分別90.5±1.7%,87.6±19.5%,91.9±2.9%,75.8±1.8%.認為這一簡便的方法能很好地保存CBHSC的造血潛能,因此它能為臍血移植凍存CBHSC.

臍血造血肝細胞(CBHSC)的冷凍保存是臍血移植工程中的重要環節之一,使用10%二甲基亞砜(DMSO)為CBHSC冷凍保護劑,程控降溫-液氮保存時采用多年行之有效的標準方法。但其成本昂貴,操作復雜,難以普及。本實驗采用-80℃冰箱降溫-液氮凍存CBHSC,取得了滿意結果,現報道如下:

1  材料和方法

1.1     主要試劑及材料  冷凍保護劑CP-1溶液(日本極東制藥廠工業株式會社),正常人血清白蛋白(衛生部上海生物制品研究所),淋巴細胞分離液(上海試劑三廠),Methocult TMCF H4534(Stem cell Technologies Inc,Canada),RPMI1640培養基(GIBCO,USA),低溫冷凍管(CREINER ,Cennany),含ACD-B的采血袋(上海血液中心)。

1.2     臍血樣本的來源  臍血樣本由廣西醫科大學一附院產科-基金項目:廣西壯族自治區教育廳自然科學基金(96048)資助提供。收集對象為無急,慢性感染及血液系統疾患的非高危妊娠產婦,且其新生兒為足月順產,出生后皮膚紅潤,無感染征象。采集方法:新生兒娩出后,立即斷臍,消毒臍帶側,行臍靜脈套管插管,臍帶血借宮縮力及位差重力作用流入血袋內(內含ACD-B液50ml),搖動混勻,直至無臍血流出為止。

1.3     臍血單個核細胞(MNC)的制備   ACD-B液抗凝的臍血用RPMI  1640培養液等倍稀釋后,置淋巴細胞分離液(1.077g/ml)的液面上,以2500 r/min,棄上清液,吸取界面層白細胞,用RPMI  1640培養液洗滌兩次后,加入含10% AB型血清的RPMI  1640培養液,制成所需濃度的MNC懸液。

1.4     臍血MNC的冷凍保存及融凍

1.4.1        冷凍保護液的制備    臍血凍存時臨時配制冷凍保護液,方法是:先將人血清白蛋白(Alb,粉劑)加入生理鹽水,制成25%人血清白蛋白溶液;按人血清白蛋白溶液與CP-1 容積比為32:68的比例,加入適量的CP-1溶液(成品每瓶68ml,含DMSO10g和HES12g)中,并在冰上緩慢混勻。此時冷凍保護液的DMSO,HES,Alb濃度分別為10%,12%及8%。

1.4.2   凍存    將等體積的MNC懸液(濃度1.05 ~2.14×10 /ml)和冷凍保護液分別裝入兩支試管中,置冰水杯中預冷,待溫度平衡后,將冷凍保護液緩慢加入細胞懸浮液中,邊加邊混勻(此步驟在冰水上操作),待冷凍保護液全部加完并充分混勻后(此時,冷凍保護劑的終濃度為5%DMSO  6%HES 及 4% Alb),分裝入容積為2ml的數支低溫冷凍管中,每管裝1.8ml,旋緊管帽,置冰水中平衡20min,隨后直接放入-80℃非控程冰箱降溫,次日從冰箱中取出,移至液氮液相中保存.于1周,1個月,3個月,6個月后自液氮中取出融凍。

1.4.3    融凍    將上述凍存的樣本小管從液氮液中取出,迅速置40℃水浴中復溫至全部融化(約3min)后,將此凍存液用含10%人AB型血清的RPMI  1640培養液緩慢稀釋5倍后,留出部分凍存液作MNC和CD+34細胞計數及臺盼蘭染色,其余部分以1500r/min 離心10min,棄上清液,用RPMI  1640培養液洗滌2次,加入含10%AB型血清的RPMI  1640培養液,制成所需濃度的MNC懸液,供CFU-GM測定。

1.5    觀察指標

1.5.1     MNC計數    用3%醋酸作細胞稀釋液,在低倍鏡下計數MNC,計算MNC的回收率。

1.5.2     臺盼蘭拒染試驗計數    0.2%臺盼蘭生理鹽水液與細胞懸液等量混合,2min后在高倍鏡下計數每100個MNC排斥臺盼蘭的存活細胞數。

1.5.3      CFU-GM測定    用甲基纖維素素法測定CFU-CM。凍存前后接種MNC懸液濃度均為1×10/ml,每份將MNC懸液0.25ml加入2.25ml的Methocult TMCF H4534(該培養體系每毫升IMDM液中含0.9%甲基纖維素,30%胎牛血清,1%牛血清,10M2-硫基乙醇,2-mML-谷胺酰胺,50ng   rh  SCF,10ng   rh  GM-CSF, 10ng   rh  IL-3)中,混勻后,于每個直徑為25mm的玻璃培養皿接種0.5ml(含MNC 0.5×10),共3皿。放入37℃,5%CO和全飽和濕度的恒溫培養箱10天,在倒置顯微鏡下計算CFU-GM的生長集落(≥50個粒單系細胞的細胞團為一個集落)數,每份取其3個培養皿集落的均數,計算CFU-GM的回收率。

1.5.4    CD+34細胞計數    用堿性磷酸酶-抗堿性磷酸敏法。將MNC懸液制成離心涂片,固定后分別加(CD+34) 第一,第二,第三,抗體及底物顯色液各20μl室溫濕盒內作用各60(第一抗體)及30min,其間各以PBS緩沖液沖洗3次,最后蘇木素復染,高倍鏡下計數1×103個MNC中,所含CD+34細胞(以細胞膜或細胞漿內有紅色標記物著染為陽性)數,計算CD+34細胞回收率。

2     結果

見表1.

3     討論

近年來骨髓及外周血干細胞的凍存出現了簡易的趨勢 1 ,即使用DMSO聯合HES作為HSC的冷凍保護劑,深低溫冰箱非程控制降溫凍存,并取得了與標準方法類似的結果5,但該方法應用于凍存CBHSC的報道甚少。

表1      臍血 MNC在液氮中保存不同時間結果

本實驗采用5%DMSO,加6%HES作為CBHSC的冷凍保護劑,與-80℃冰箱非程控制溫后,移至液氮液中保存。保存6個月后,MNC,CFU-GM及CD+34細胞的回收率為90.5±1.7%,87.6±19.5%,91.9±2.9%,臺盼蘭據染率為75.8±1.8%,與Broxmeyer等⑹報道的使用10%DMSO作冷凍保護劑,程控降溫后液氮保存CBHSC的結果一致。筆者認為-80℃冰箱非程控降溫-液氮保存CBHSC可獲得良好的效果。

與標準的方法比較具有下列優點:
①.DMSO與HES聯合用作冷凍保護劑,能發揮協同作用,減少DMSO用量,因而可減輕DM-SO對人體及造血細胞的毒性作用3.7。katayama等人⑷試驗擺明5%DMSO至少在融凍后1h內不會對造血干細胞造成毒性影響,這給融凍后造血干細胞的處理提供了時間的保證;
②.可避免程控降溫的時間消耗及復雜的操作;
③可節省購買程控降溫設備的費用;
④與-80℃冰箱直接凍存法比較,可克服由于供電不穩所帶來的麻煩,為臍血移植提供了CBHSC凍存的新途徑。本次試驗凍存CBHSC的方法短期內可為臍血移植凍存CBHSC,但其長期凍存的效果尚待進一步觀察。

本文網址:http://www.thomastrials.com/shiyan/873.html
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