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菌種保藏技術的原理及方法

作者:天馳液氮罐 來源:原創 日期:2014-12-25 8:42:06 人氣:65 加入收藏 標簽:

  菌種是主要的生物資源,也是食用菌生產首要的生產資料。一個優良的菌種被選育出來以后,必須保持其優良性狀不變或盡可能地少變慢變,才不至于降低生產性能,能長期在生產中使用。因此,菌種保藏在食用菌生產上具有重要的意義。

  一、菌種保藏原理

  菌種保藏的方法很多,但原理大同小異。首先要挑選優良純種。利用微生物的孢子、芽孢及營養體;其次,根據其生理、生化性,人為創造低溫、干燥或缺氧等條件,抑制微生物的代謝作用,使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態,從而延長菌種生命以及使菌種保持原有的性狀,防止變異。不管采用哪種保藏方法,在菌種保存過程中要求不死亡、不污染雜菌和不退化。

  二、菌種保藏的方法

  1、低溫定期移植保藏法。將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養基上,適溫培養,當菌絲健壯地長滿斜面時取出,放在3-5℃低溫干燥處或4℃冰箱、冰柜中保藏,每隔4-6個月時間移植轉管一次,具體應根據菌種特性決定。保藏時要注意環境溫度不能太高,以防霉菌通過棉塞進入管內。因此,若用棉塞,可用干凈的硫酸紙或牛皮紙包扎棉塞,即可減少污染的機會,也可防止培養基干燥。除草菇菌種外,其他食用菌菌種都能采用此法保藏。

  2、液體石蠟保藏法。取化學純液體石蠟(要求不含水分、不霉變)裝于三角瓶中加棉塞并包紙,在1公斤/平方厘米壓力下滅菌1小時,再放入40℃恒溫箱中數天,以蒸發其中水分,至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接在空白斜面上,28-30℃下培養2-3天,證明無雜菌生長方可使用。然后用無菌操作的方法把液體石蠟注入待保藏的斜面試管中。注入量以高出培養基斜面1-1.5厘米,塞上橡皮塞,用固體石蠟封口,直立于低溫干燥處保藏。保藏時間在一年以上,在低溫下,保藏時間還可延長。

  3、沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗滌數次,過60目篩除去粗粒,再用10%鹽酸浸泡2-4小時,除去其中有機物質,再用水沖洗至流水的ph達到中性,烘干備用。同時取貧脊土或菜園土用水浸泡,使呈中性,沉淀后棄去上清液,烘干碾細,用100目篩子過篩,將處理好的沙與土以(2-4):1混勻,用磁鐵吸出其中的鐵質,然后分裝小試管或安瓿內,每管裝量0.5-2克,塞棉塞,用紙包扎滅菌(1.5公斤/平方厘米,1小時),再干熱滅菌(160℃,2-3小時)1-2次,進行無菌檢驗,合格后使用。將已形成孢子的斜面菌種,在無菌條件下注入無菌水3-5毫升,刮菌苔,制成菌懸液,再用無菌吸管吸取菌液滴入砂土管中,以浸透砂土為止。將接種后的沙土管放入盛有干燥劑的真空干燥器內,接上真空泵抽氣數小時,至沙土干燥為止。真空干燥操作需在孢子接入后48小時內完成,以免孢子發芽。制備好的沙土管用石蠟封口,在低溫下可保藏2-10年。

  4、濾紙片保藏法。取白色(收集深色孢子)或黑色(收集白色孢子)濾紙,剪成4×0.8厘米的小紙條,平鋪在培養皿中用紙包裹進行滅菌(1公斤/平方厘米,30分鐘)。采用鉤懸法收集孢子,讓孢子落在濾紙條上。將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中,再將保藏試管放入干燥器中1-2天,除去濾紙水分,使濾紙水分含量達2%左右,然后低溫保藏。

  5、自然基質保藏法

 ?、披溋12胤ǎ喝o癟粒、無雜質的小麥淘洗干凈,浸泡12-15小時,加水煮沸15分鐘,繼續熱浸15分鐘,使麥粒脹而不破,瀝干水分攤開晾曬,使麥粒的含水量在25%左右。將碳酸鈣、石膏拌入熟麥粒中(麥粒、碳酸鈣、石膏比例為10公斤:133克:33克),拌和均勻后裝入試管中,每管約2-3克,然后清洗試管,塞棉塞,滅菌1.5(1.5公斤/平方厘米,2小時),經無菌檢查合格后備用,試管基質冷卻后接種,適溫培養,待菌絲長滿基質后用石蠟涂封棉塞,放低溫保藏。2年左右轉接一次。

 ?、汽熐2胤?。取新鮮麩皮,過60目篩除去粗粒。將麩皮和自來水按1:1拌勻,裝入小試管,每管約裝1/3高度,加棉塞用紙包扎,高壓滅菌(1.5公斤/平方厘米,30分鐘),經無菌檢查合格后備用,將生長在斜面培養基上的健壯菌種,移種至無菌麩曲管中,移種時注意盡管搗勻小試管中的麩皮,呈疏松狀態,在適溫下培養至菌絲長滿麩皮為止,將麩曲小管置干燥器中,在低溫或適溫下保藏。

  6、生理鹽水保藏法。取純氯化鈉0.7-0.9克,放入100%毫升蒸餾水中,攪拌均勻分裝試管,每管5-10毫升,進行滅菌(1公斤/平方厘米,30分鐘),經無菌檢查合格后備用,將待保藏的菌種接入馬鈴薯葡萄糖液體培養基中適溫振蕩培養5-7天。無菌操作吸取少許培養菌種注入經檢驗合格的生理鹽水試管中,塞上無菌橡皮塞,用石蠟涂封,在室溫或低溫保藏。

  7、冷凍真空干燥法。將已培養、生長豐富的菌體或孢子懸浮于滅菌的血清、卵白、脫脂奶制成菌懸液,將懸液以無菌操作分裝于滅菌的玻璃安瓿瓶中,每管約0.3-0.5毫升,然后用耐壓橡皮管與冷凍干燥裝置連接,安瓿瓶放在冷凍槽中于-30℃至-40℃迅速冷凍,并在冷凍狀態下抽空干燥,并在真空狀態下熔封安瓿,在-20℃保存,一般可保存十年以上,但成本較高。

  8、液氮超低溫保藏法。首先將要保藏的菌種制成菌懸液備用;其次,準備安瓿瓶,每瓶加入0.8毫升冷凍保護劑10%(體積比)甘油蒸餾水溶液,塞棉塞滅菌(1公斤/平方厘米,5分鐘)。無菌檢查后,接入要保藏的菌種,火焰熔封瓶口,檢查是否漏氣,將封好口的安瓿瓶放在凍結器內,以每分鐘下降1℃的速度緩慢降溫,使保藏品逐步均勻地凍結,直至-35℃,以后凍結速度就不需控制,安瓿凍結后立即放入液氮罐內,在-150至-196℃保藏,該法只有少數科研院所使用。

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